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抵抗气溶胶造成的模板污染,Luna qPCR试剂有妙招

版权所有,转载请联系基因市场部
2019-05-07

核酸气溶胶污染大概是分子生物学实验室最痛恨的东西之一,经常与PCR实验相伴出现。所谓核酸气溶胶,是指悬浮于气体介质中的直径为0.001~1000微米的,含有核酸的液体微小粒子,广泛存在于实验室桌面、仪器、耗材及空气中。由于RNA容易被降解,所以带来危害的主要是DNA气溶胶。核酸气溶胶落入PCR反应体系中,会成为扩增的模板,导致检测结果出现假阳性。


想知道您的实验环境中是否存在气溶胶污染,只需要设置一个空白对照,即不含模板DNA,但含有PCR体系中所有其他成分的对照反应。若空白对照中出现扩增产物,我们认为PCR的结果是不可信的。对于灵敏度更高的qPCR实验来说,痕量的气溶胶污染都可能造成实验结果的假阳性。


酒精擦拭、紫外照射、气溶胶污染清除剂等,都是用于处理环境中的污染的办法,但是当空气中的核酸气溶胶可能落入PCR试剂,造成持续性污染时,往往就只能丢弃试剂。针对这一问题,NEB给出了新的解决方案。Luna通用型qPCR预混液中使用了dUTP,从而可以在扩增过程中将U掺入到DNA产物中。因此,即使扩增产物变成气溶胶,造成了污染,也可以通过在反应体系中加入终浓度0.2 units/μl 的南极热敏尿嘧啶 DNA 糖基化酶(简称南极热敏UDG,M0372),25℃温育10分钟来完全解决。南极热敏UDG能有效地水解DNA上的尿嘧啶,产生缺嘧啶位点。后者在高温下极易水解断裂,从而达到降解气溶胶模板的效果。同时该酶对高温敏感,在后续的qPCR的变性步骤中就可以被完全失活,因此不会影响正在进行的检测。

NEB Luna去除模板污染示意图

此外,预混液中还加有非荧光染料,便于建立反应时进行肉眼观察,该染料的光谱与 qPCR 荧光染料不重叠,因此不会影响到实时检测数值。


经过优化的NEB Luna Universal qPCR Master Mix含有热启动 Taq DNA 聚合酶及独特校正染料,在大部分具有SYBR?/FAM通道的qPCR设备上都有出色的表现,而且无需额外添加ROX进行校正。

使用 Luna Universal qPCR Master Mix 检测目标中 GAPDH 基因的表达情况,模板为 6个分别 10 倍稀释的 Jurkat cDNA (20 ng – 0.2 pg),每个浓度的样品做8个复孔。cDNA 是使用 NEB Protoscript? II First Strand cDNA Synthesis Kit (E6560) 从 Jurkat 的总 RNA 反转录得来。


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